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B. extrazelluläre signalbezogene Kinase, ERK1/2, und c-jun n-terminale Kinase, Jnk)7,8,9.Integrine, Transmembranrezeptoren, die Zelladhäsionen bilden und an Peptidmotive in der extrazellulären Matrix ligieren, wie RGD, verbinden sich mit Signalproteinen wie fokaler Adhäsionskinase, FAK und dem Aktin-Zytoskelett, um phänotypgebundene Signalwege zu bewirken10,11,12 .Diese Mitogene sind bekannt für ihre Rolle bei der SSC-Differenzierung zusammen mit der Rho-A-Kinase-Signalgebung, um die Adipogenese zu erleichtern, wo ein Mangel an Ausbreitung zu einer geringen Mitogenstimulation und einem Mangel an intrazellulärer Spannung führt, oder um die Osteogenese durch Mitogenaktivierung von Transkriptionsfaktoren wie Runt-verwandten voranzutreiben Transkriptionsfaktor 2 (RUNX2) und adhäsionsgetriebene Ausbreitung sorgen für ein hohes Maß an intrazellulärer Spannung13,14,15.Wenn angenommen wird, dass SSCs spannungsbezogene Phänotypen des Zytoskeletts haben, repräsentieren Adipozyten eine sehr niedrige Spannung, Fibroblasten eine mittlere Spannung und Osteoblasten eine hohe Spannung.Es zeichnet sich ab, dass die SSC-Selbsterneuerung mit leicht reduzierter Spannung des Fibroblasten-Phänotyps auftritt6,9.Dies ist sinnvoll, da SSCs eine ähnliche Morphologie wie Fibroblasten im Gegensatz zu Adipozyten oder Osteoblasten haben, die ursprünglich als koloniebildende Einheiten von Fibroblasten definiert wurden16.Tatsächlich ist der Morphologie-Spannungsunterschied zwischen einem Fibroblasten und dem SSC in Kultur bescheiden und hat dennoch einen signifikanten Einfluss zwischen wachsenden Fibroblasten und einem wichtigen regenerativen Stammzelltyp6,9.Um den SSC-Phänotyp aufrechtzuerhalten, scheinen die Mitogene den Zellzyklus in einer Weise zu regulieren, die die SSC-Fähigkeit zur Differenzierung reduziert.Zum Beispiel wird phosphoryliertes Retinoblastom-Protein, ein negativer Regulator des Zellzyklus, der mit der RUNX2-Aktivierung assoziiert ist, im Vergleich zu differenzierenden SSCs und Cyclin-abhängiger Kinase 6, einem positiven Regulator des Zellzyklus, der die zelluläre BMP-2-Empfindlichkeit (bone morphogenetic protein) reduziert, herunterreguliert , wird in selbsterneuernden SSCs hochreguliert8,17,18.Wie von Stein und Lian im Jahr 1993 sowie zeitgenössischen Studien berichtet, wird das Wachstum reduziert, um eine SSC-Differenzierung zu ermöglichen19,20.Dies bedeutet, dass differenzierte Nachkommen wie Adipozyten und Osteoblasten dazu neigen, langsam zu wachsen, während sich selbsterneuernde SSCs wie Fibroblasten schnell vermehren8,9.Es sind jedoch diese differenzierten Nachkommen, die in großer Zahl benötigt werden, um eine klinische Therapie zu ermöglichen.Knochen ist zum Beispiel nach Blut das am zweithäufigsten transplantierte Gewebe, und Knochentransplantate sind knapp21.Transplantat kann als Autotransplantat von Spenderstellen entnommen werden, aber die Menge ist begrenzt und es treten Schmerzen und Morbidität an der Spenderstelle auf22,23.Das Allotransplantat wird zwangsläufig dezellularisiert und es fehlt daher „die Biologie“ (dh die Zellen), die für eine effiziente Reparatur erforderlich ist21.Tissue Engineering unter Verwendung von Osteoblasten stellt eine Zukunftsvision dar, bei der im Labor gezüchtete Osteoblasten auf einem osteogenen Gerüstmaterial mit geeigneten biologischen und biomechanischen Hinweisen kultiviert werden24,25,26.Daher besteht die Notwendigkeit, von der Verwendung von Kulturgefäßen aus Kunststoff, die für das Wachstum anspruchsvoller Zelllinien27 entwickelt wurden, zu Strategien überzugehen, die speziell für Stammzellpopulationen entwickelt wurden, um das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung zu erleichtern.Diese Strategien können die Form von 3D-Gelen oder Mikroperlen annehmen27, aber hier werden wir uns auf eine neuartige Strategie zur Oberflächenfunktionalisierung konzentrieren.Insbesondere werden wir uns auf eine Strategie konzentrieren, die darauf ausgelegt ist, zunächst die SSC-Selbsterneuerung, die Zellzahlexpansion und anschließend die knochenspezifische Differenzierung zu fördern, um einen regenerativen Zelltyp zu produzieren, wo ein klinischer Bedarf besteht.Darüber hinaus ist ein zentrales Ziel die Entwicklung einer autonomen, zellengesteuerten Plattform anstelle einer benutzergesteuerten Art und Weise.Eine wachsende Zahl von Studien hat dynamische Materialien für die SSC-Kultur identifiziert.Beispielsweise veranschaulichen photoaktive Hydrogele, dass die Wachstumskontrolle in solchen Systemen zwar schlecht bleibt, aber ein Potenzial besteht, die Osteogenese von SSCs über kurze Kulturzeiten zu steuern28.Auch über elektroaktive Oberflächen29,30,31 und auf Proteine ​​ansprechende Materialien32 wird berichtet.Diese Studien beruhen jedoch auf nicht biokompatibler Chemie und der Anwendung von leitenden Materialien/elektrochemischen Potentialen, die die Zellreaktion beeinflussen können.Abbau33 und Spannungsrelaxation34 von viskoelastischen Hydrogelen bilden ebenfalls weitere Strategien, die den SSC-Phänotyp dynamisch anpassen können;diese Eigenschaften können jedoch schwer zu kontrollieren sein.Wir haben eine oberflächenbasierte Strategie angepasst, die zuvor beschrieben wurde, um enzymatische Aktivierung zu verwenden, um einen natürlichen Stimulus unter Benutzerkontrolle bereitzustellen, um Änderungen der Materialeigenschaften auszulösen, mit Vorteilen der Biokompatibilität und Selektivität35.Dieser Oberflächenansatz basierte auf Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) direkt auf der festen Oberfläche, die verwendet wurde, um eine enzymatisch spaltbare Sequenz zu erzeugen, um das zelladhäsive Tripeptid, RGD, gegenüber SSCs freizulegen.Die Sequenz A↓ARGD (Pfeil bezeichnet die Elastase-Spaltstelle) wurde mit der voluminösen blockierenden Gruppe Fmoc (Fluorenylmethyloxycarbonyl) verschlossen, von der gezeigt wurde, dass sie den sterischen Zugang zu der darunter liegenden RGD verhindert (Todd et al.,36https://pubs.rsc.org/en/ content/articlelanding/2007/sm/b618256a/unauth) und anschließend mit PEG [Ref] und kovalent an Glassubstrate unter Verwendung eines Polyethylenglykol(PEG)-Linkers gebunden.Es wurde festgestellt, dass die SSCs mit Fmoc (oder PEG) an Ort und Stelle kleinere Adhäsionen produzierten, weniger Myosin-induzierte intrazelluläre Spannung erzeugten und Marker des Stammzellphänotyps beibehielten.Wenn die blockierende Gruppe jedoch mit Elastase gespalten wurde, produzierten die SSCs osteoblastenspezifische superreife Adhäsionen (Zelladhäsionen > 5 µm lang)37, erhöhten die Myosin-Phosphorylierung und differenzierten sich entlang der Osteoblasten-Linie38.Die aktuellen Studien beschreiben detailliert die Entwicklung einer zellgesteuerten Oberfläche, bei der AA durch einen Peptidlinker ersetzt wird, der für die Wirkung der Matrix-Metalloprotease (MMP) empfindlich ist.Die zu testende Hypothese war, dass die Akkumulation von MMPs, wie MMP-2, die typischerweise von SSCs exprimiert werden, wenn sich die Zellen der Konfluenz nähern39, die Blockierungsgruppe spalten könnte, um RGD freizulegen (Abb. 1a).Wir stellen fest, dass in der früheren Arbeit38 die Fmoc-Blockierungsgruppe biofouled werden könnte, wodurch die AA-Spaltung verhindert wird, und daher wurde die Antifouling-PEG-Gruppe als Blocker verwendet.Auswählen von MMPs und Spaltungssequenz.(a) Schematische Darstellung des SSC-spaltbaren Oberflächenkonzepts mit MMP-gesteuerter Entfernung von PEG, wodurch RGD für die Zellen sichtbar wird.(b) Nach 3-wöchiger Kultur wurde ein MMP-Protein-Array durch densitometrische Messungen der Array-Membranen durchgeführt, die hohe MMP-2-Expressionsniveaus zeigten (n = 3).(c, d) ELISA zeigte eine konstante Expression von MMP-2 und eine zunehmende Expression von MMP-9 mit der Zeit (n = 3).(e) Zymographie wurde verwendet, um zu zeigen, dass nur MMP-2 von den SSCs in aktiver Form nach 3 Wochen Kultur (n = 3) exprimiert wurde.(f) MERPOS-Daten ergaben einen Konsens einer 8-Aminosäuresequenz mit einer starken Präferenz für L an P1';was es uns ermöglichte, eine GPAG↓LRGD-Sequenz für die MMP-2-Spaltung zu entwerfen, die RGD auf dem Deckglas hinterlassen würde.(g) Die GPAG↓LRGD-Sequenz wird häufig als MMP-responsiv bezeichnet. Für (b–e) sind die Ergebnisse Mittelwerte ± SD, Statistiken durch ANOVA und Tukey-Test, wobei *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001.Wenn in den Diagrammen in (b–e) keine Sterne angezeigt werden, bedeutet dies, dass kein signifikanter Unterschied zwischen der Behandlung und der relevanten Kontrolle beobachtet wurde.Nach der Kultivierung von SSCs (Stro-1+ve adhärente Zellen aus menschlichem Knochenmark mit Stammzelleigenschaften, die sowohl durch angereicherte CFU-F-Bildung als auch durch In-vivo-Knochenbildung40,41 gezeigt werden) auf Gewebekulturkunststoff wurde der Zellüberstand für die MMP-Analyse gesammelt .Zuerst wurde ein MMP-Protein-Array nach 3 Wochen Kultur verwendet, um zu zeigen, dass MMP-2 im Überfluss exprimiert wurde (Abb. 1b).MMP-2 ist Kollagenase, die von SSCs exprimiert werden kann39,42.Wir stellen fest, dass die MMP-9-Expression auch in SSCs in der Literatur erwähnt wird39,42 und daher wurde sowohl die MMP-2- als auch die MMP-9-Expression durch ELISA über einen Zeitraum von 6 Wochen quantifiziert.MMP-2 wurde konstant exprimiert (Fig. 1c), während die MMP-9-Expression mit der Zeit notiert wurde (Fig. 1d).Es ist wichtig anzumerken, dass MMPs sowohl in inaktiver als auch in aktiver Form exprimiert werden können und daher Zymographie verwendet wurde, um die MMP-2- und 9-Aktivität nach 3 Wochen Kultur zu quantifizieren.Die Ergebnisse zeigten, dass nur MMP-2 signifikant in einer aktiven Form exprimiert wurde, verglichen mit der in Zellkulturmedien gefundenen (Abb. 1e).Da MMP-2 von den SSCs in aktiver Form exprimiert wird, entschieden wir uns daher, eine Spaltungssequenz zu entwerfen, die auf MMP-2-Aktivität anspricht.Um die Peptidsequenz der spaltbaren Bindung zu definieren, verwendeten wir die MEROPS-Datenbank43, die anzeigte, dass die MMP-2-Sequenzpräferenz aus einer 8-Aminosäuren-Peptidsequenz (P4–P4′) bestand.Für die P1- und P1′-Spaltstelle zeigte die Datenbank eine Präferenz für kleine Aminosäuren an, wobei G oder A an P1 gleichermaßen wahrscheinlich sind, Literaturberichte geben jedoch konsistent an, dass L an P1′ bevorzugt wird (1387 Zitate) (Ergänzende Abb. S1, Abb. 1f).Wir entwarfen daher eine Peptidspaltungssequenz mit RGD, eingebaut an der Primseite, die auf dem Deckglas nach der MMP-Aktivität verbleiben würde;die endgültige GPAG↓LRGD-Sequenz wurde fast 1500 Mal als MMP2-sensitiv zitiert (Abb. 1g).Es wurden Deckgläser hergestellt, um den Zellen PEG-GPAG↓LRGD-PEG-Glas zu präsentieren (Oberflächen mit dieser vollständigen Sequenz werden als DIGE-D für verdaulich mit RGD bezeichnet).Zur Herstellung der Zellkulturoberflächen wurden Glasdeckgläser gereinigt, silanisiert und ein PEG-Linker angebracht.Die Peptidsequenz wurde unter Verwendung von Fmoc-geschützten Aminosäuren aufgebaut, die von unten nach oben gepfropft wurden, und die vollständige Sequenz wurde unter einer zweiten PEG-Kette verborgen.Fluoreszenzspektroskopie zum Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von Fmoc44 (Abb. 2a) und Messungen des Wasserkontaktwinkels (WCA), wiederum zum Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens der hydrophoben Fmoc-Gruppe (Abb. 2b), wurden verwendet, um die Synthese des MMP zu verfolgen -2 spaltbare Oberfläche (Abb. 2c).Charakterisierung der dynamischen Oberfläche der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS).(a) Oberflächenfluoreszenzspektroskopie nach Hinzufügen/Entfernen der Fmoc-Gruppe (Fmoc-Peak bei ~315 nm) während der Synthese.(b) Kontaktwinkelmessung nach Hinzufügung (rot)/Entfernung (blau) der Fmoc-Gruppe während der Synthese und der endgültigen PEG-bedeckten Peptidsequenz (grün) (Diagramm zeigt Mittelwert ± SD, 50 Bilder pro Datensatz mit 15 Datensätzen, die über 3 aufgenommen wurden Substrate (n = 3)).(c) Schema, das die vollständige RGD-Oberfläche mit MMP-spaltbarer Gruppe und PEG-Blocker vor und nach MMP-Spaltung zeigt.(d) Tof-SIMS-Daten, die zeigen, dass die erwarteten Aminosäuren (G, P, A, L, R und D) und PEG nach der Synthese vorhanden waren.Zusammen zeigen diese Daten eine vollständige PEG-GPAGLRGD-Synthese.Zusätzlich zur WCA- und Fluoreszenzspektroskopie wurde Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie (TOF-SIMS) verwendet, um das Vorhandensein der Aminosäuren nachzuweisen, die zum Aufbau der MMP-2-responsiven Peptidsequenz auf den Deckgläsern verwendet wurden (Abb. 2d).Auf der Peptidoberfläche wurden Ionen, die mit allen sechs Aminosäuren (Ala, Gly, Asp, Arg, Pro und Leu) und der PEG-Kette verwandt sind, nachgewiesen.Die Intensität des Si+-Ions nimmt nach der Peptidanlagerung erheblich ab, was darauf hindeutet, dass die Probenoberfläche modifiziert wurde.Während einige der mit Aminosäuren verwandten Ionen auch auf der Kontrollprobe (sauberes Glas) vorhanden waren, zeigten alle Ionen außer denen, die mit Ala (C2H6O+) assoziiert sind, eine signifikante Zunahme der Intensität nach der Peptidmodifikation.Der Nachweis des C2H6O+-Ions auf der Kontrollprobe und das daraus resultierende Ausbleiben einer deutlichen Erhöhung der Intensität dieses Ions auf der Peptidprobe lässt sich damit erklären, dass das (C2H6O+)-Ion ein generisches Ion ist, das auch aus zufälligem Kohlenstoff stammen kann Verunreinigungen.Aminosäuren und die PEG-Gruppe waren nach der Synthese vorhanden (Abb. 2d).Darüber hinaus ist die Verteilung dieser Ionenintensitäten über eine größere Oberfläche weitgehend homogen, was zeigt, dass die Oberflächenmodifikation über das Deckglas ziemlich gleichmäßig ist.Nach unserem zuvor entwickelten Protokoll34 bestätigen die Überwachung der sequentiellen Anlagerung von Aminosäuren durch Fluoreszenz- und WCA-Messungen und die Bestätigung der gesamten Oberflächenchemie durch ToF-SIMS kombiniert, dass die richtige Peptidsequenz auf der Oberfläche hergestellt wurde.Betrachtet man die Wirkung der Zugabe von serumfreiem Medium, das entweder mit MMP-2 oder MMP-9 (20 ng/ml bzw. 0,25 ng/ml) versetzt wurde, kann die Feststellung der spaltbaren Bindungen MMP promiskuitiv sein und dennoch ein Interesse an den hohen Konzentrationen haben von MMP-9, obwohl inaktiv, wie in Abb. 1d zu sehen, zeigte TOF-SIMS eine Reduktion der P- und A-Aminosäuren sowie der Capping-PEG-Gruppe im Vergleich, wenn sowohl MMP-2 als auch 9 zur vollständigen Peptidsequenz hinzugefügt wurden, was darauf hindeutet erfolgreiche Spaltung (§ gespalten im Vergleich zu $ ​​ungespalten) (ergänzende Abb. S2).Abbildung 3a,b zeigt die Entfernung von PEG durch exogenes MMP-2 und MMP-9.MMPs können PEG vom Peptid abspalten und RGD aufdecken.( a, b ) Tof-SIMS-Daten, die die Entfernung der PEG-Gruppe mit der Zugabe von MMPs-2 und 9 detaillierter zeigen.(c) Die Behandlung der DIGE-D-Oberfläche mit SSC-Überstand, der 10 ng/ml MMP-2 (aktiv) und 0,4 ng/ml MMP-9 (latent) enthielt, führte zu einer gewissen Spaltung von PEG.Abbildung 1c,d zeigte, dass ~ 10 ng/ml endogenes MMP-2 und ~ 0,4 ng/ml endogenes MMP-9 von den SSCs in Kultur exprimiert wurden.Um zu testen, ob diese Konzentrationen die spaltbare Bindung in der Peptidsequenz unter Serum-enthaltenden Bedingungen spalten könnten (d. h. wo Konkurrenzproteine ​​vorhanden sein können, auf die die MMPs wirken können), wurden Medien nach 3 Wochen der Kultivierung der SSCs auf Glas gesammelt der Sequenz vor der TOF-SIMS-Analyse hinzugefügt.Es war ersichtlich, dass die mit dem Überstand behandelte Oberfläche eine verringerte PEG-Signalintensität aufwies, was auf eine erfolgreiche Entfernung der PEG-Blockierungsgruppe hinweist, wenn auch mit verringerter Effizienz im Vergleich zur Verwendung von exogenen MMPs unter serumfreien Bedingungen ( 3c ).Wir stellen fest, dass wir auch eine Proteinadsorption aus dieser Probe sehen, daher muss die Quantifizierung mit einiger Vorsicht interpretiert werden (ergänzende Abb. S3).Um die Biokompatibilität der Oberfläche und die Zelladhäsion an der Oberfläche zu verstehen, haben wir einige Kurzzeitexperimente mit einer Reihe von Glas-, RGD- (hohe Zelladhäsion) und RGE- (niedrige Zelladhäsion) Kontrollen durchgeführt, wie in Tabelle 1 gezeigt.Es wurde beobachtet, dass SSCs nach 24 h Kultur auf allen Oberflächen lebensfähig waren, aber SSCs eine verringerte Zellausbreitung (Messung der Zellfläche) auf RGE-haltigen Oberflächen zeigten, was die geringe Adhäsion der RGE-Gruppe widerspiegelt (Abb. 4a, b).Nach 24 h SSC-Kultur beobachteten wir die Zytoskelettproteine ​​Tubulin und Vimentin, die an der Zellstoffwechselaktivität beteiligt sind, und beobachteten/gemessenen die fokale Adhäsionsgröße (Abb. 4b).Tubulin-Mikrotubuli und Vimentin-Zwischenfilamente spiegelten die Zellflächendaten mit einer Neigung zur verstärkten Zellausbreitung wider, wobei sie organisierte Tubuli und Filamente auf RGD-enthaltenden Oberflächen zeigten.Die Vinculin-Färbung zeigte, dass Zellen Adhäsionen auf allen Oberflächen bilden konnten, einschließlich RGE-enthaltender Oberflächen (Fig. 4b, c).Messung der Adhäsionslänge und Unterteilung in fokale Komplexe (kleine, vorübergehende Adhäsionen < 2 µm lang), fokale Adhäsionen (stabile Adhäsionen 2–5 µm lang) und superreife Adhäsionen (sehr große Adhäsionen, die zur Unterstützung der Osteogenese erforderlich sind, > 5 µm lang), zeigte, dass die gespaltene LRGD-Probe die überreifsten Adhäsionen enthielt, wobei RGE enthaltende Oberflächen die wenigsten überreifen Adhäsionen pro Zelle unterstützten (Fig. 4c).SSC-Biokompatibilität.(a) Zellflächenmessungen nach 24 h Kultur an den Proben, die zeigen, dass RGD-haltige Oberflächen und DIGE-E eine ähnliche Zellausbreitung im Vergleich zu Glas unterstützten, während LRGE, wo das RGE exponiert war, die SSC-Ausbreitung reduzierte (n = 15).(b) Lebensfähigkeits-, Proliferations- und Zytoskelettanalysen zeigten eine hohe Zelllebensfähigkeit auf allen Oberflächen.Wachstum und Organisation des Zytoskeletts waren auf der LRGE-Oberfläche und der PEG-RGE-Oberfläche, wo die RGE-Gruppe exponiert war, reduziert.(c) Fokale Adhäsionen wurden als FC (< 2 µm), FA (2–5 µm) und SMAdh (> 5 µm) kategorisiert und als % Gesamtadhäsion (n = 15) ausgedrückt.Der Hauptunterschied zum Anzeigen von Zellen, die auf die PEG-Spaltung ansprachen, wurde in den SMAdhs gesehen, wo LRGD und DIGE-D die größten Unterschiede zu den RGE-enthaltenden Oberflächen ergaben.(d) Alamarblau- und MTT-Stoffwechselassays zeigen keine Unterschiede (n = 3).Diagramme zeigen Mittelwert ± Standardabweichung, Statistik durch ANOVA und Tukey-Test, wobei *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001.Wenn in den Diagrammen keine Sterne angezeigt werden, bedeutet dies, dass kein signifikanter Unterschied zwischen der Behandlung und der relevanten Kontrolle beobachtet wurde.Bitte beachten Sie, dass SSCs, die von Promocell GMBH gekauft wurden, anstelle von Stro-1+ve-Zellen verwendet wurden, um diese Figur zu erstellen.Nach 1 Woche Kultivierung auf den Oberflächen wurden Alamarblau-Reduktion und MTT-Assays verwendet, um die Zellstoffwechselaktivität als Maß für das Wachstum zu berechnen.Es gab keine Unterschiede zwischen den Oberflächen, was auf ähnliche Zellzahlen hindeutet (Abb. 4d, e).Wiederum zeigte der Einbau von Bromdeoxyuridin (BrdU) nach 1 Woche S-Phasen-Zellen, die auf allen Materialien vorhanden waren (Fig. 4b).Zusammengenommen deuten diese Daten auf eine Verzögerungsphase der Zelladhäsion auf RGE-enthaltenden Oberflächen hin, was zeigt, dass die anfängliche Zellreaktion je nach Probe ziemlich unterschiedlich ist, dass sich die Zellen jedoch mit der Zeit auf ein Niveau ausbreiten und vermehren können, das mit Zellen auf der Glaskontrolle vergleichbar ist.Um den Phänotyp zu untersuchen, wurden SSCs auf den vollständigen Substraten (GPAG↓LRGD, DIGE-D, GPAG↓LRGE und DIG-E) für bis zu 6 Wochen kultiviert.Zuerst betrachteten wir die Stro-1-Expression als SSC-Marker nach 4 Wochen Kultur.In der Cell-Western-Analyse zeigte sich, dass die Stro-1-Expression bei allen Proben, Glaskontrolle, DIGE-D und DIGE-E, ähnlich mit der Zeit abnahm (Fig. 5a).Dies weist darauf hin, dass die DIGE-D-Probe in frühen Stadien der Kultur keine Abstammungsbindung fördert und dass die SSCs auf das osteogene RGD45 reagieren sollten, wenn es aufgedeckt wird.SSC-Phänotyp auf DIGE-D-Oberfläche.(a) In Cell Western (ICW) Daten für Stro-1 zeigen keinen Unterschied zwischen SSCs, die auf Glaskontroll- und DIGE-D- und DIG-E-Oberflächen kultiviert wurden, was zeigt, dass Zellen ähnliche Mengen dieses SSC-Markers auf den SPPS-Test- und Kontrolloberflächen exprimieren, wenn das RGD/RGE wird durch die PEG-Blockierungsgruppe verborgen.(b,c) ICW-Daten für alkalische Phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN) und Osteocalcin (OCN) nach 4 Wochen (b) und 6 Wochen (c) Kultur.Nach 4 Wochen wurden keine Unterschiede zwischen den Proben festgestellt, aber nach 6 Wochen wurden höhere Niveaus der OCN-Expression in SSCs auf der DIGE-D-Oberfläche festgestellt.(d) QPCR für OPN-Transkripte nach 4 und 6 Wochen MSC-Kultur auf PEG-, LRGD- und DIGE-D-Oberflächen.Nach 4 Wochen war keine Veränderung zu sehen.Nach 6 Wochen unterstützte die auf DIGE-D MMP ansprechende Oberfläche jedoch eine signifikant stärkere OPN-Expression.Diagramme zeigen Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3, Statistiken durch ANOVA und Tukey-Test, wobei *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001.Wenn in den Diagrammen keine Sterne angezeigt werden, bedeutet dies, dass kein signifikanter Unterschied zwischen der Behandlung und der relevanten Kontrolle beobachtet wurde.SSCs wurden dann nach 4 und 6 Wochen SSC-Kultur auf den Oberflächen auf osteogene Markerproteine ​​alkalische Phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN) und Osteocalcin (OCN)19 untersucht.Nach 4 Wochen war kein Unterschied zwischen den Proben zu sehen, was darauf hinweist, dass keine Osteogenese einsetzte (Fig. 5b).Nach 6 Wochen wurde jedoch ein Anstieg der OPN festgestellt, was wichtig ist, nur auf der DIGE-D-Oberfläche (Abb. 5c).Dies weist auf eine potenzielle Osteogenese bei der MMP-2-spaltbaren, RGD-enthaltenden Probe gegenüber der auf Glas- oder RGE-enthaltenden Kontrollen hin, wo eine phänotypische Fibroblastendrift vermutet wird.Als nächstes wurde qPCR verwendet, um die OPN-Expression in SSCs nach 4 und 6 Wochen zu untersuchen, die auf den LRGD- und MMP-2-responsiven DIGE-D-Oberflächen im Vergleich zu PEG-Kontrollen kultiviert wurden.Es wurde erneut beobachtet, dass es nach 4 Wochen keine Expression von OPN gab.Jedoch wurde nach 6 Wochen Kultur eine signifikant größere OPN-Expression auf DIGD-D im Vergleich zu LRGD und PEG festgestellt (Fig. 5d).Dieses Ergebnis stimmt mit den in Ref. 38 präsentierten Daten überein, die veranschaulichen, dass, wenn Elastase verwendet wird, um die Blockierungsgruppe zu spalten, um RGD aufzudecken, im Vergleich zur Verwendung von RGD allein eine verstärkte Osteogenese festgestellt wird;dh die Offenlegung einer durch RGD verstärkten osteogenen Bindung.Bei der Betrachtung von Markertranskripten für andere Linien wurde festgestellt, dass die DIGE-D-Oberfläche osteospezifisch ist (ergänzende Abb. S4).Wir haben eine MMP-responsive Oberfläche für die SSC-Kultur entwickelt.Unter Verwendung exogener, aktiver MMPs zeigen wir, dass die PEG-Blockierungsgruppe effizient gespalten werden kann, um RGD aufzudecken.Die aktuellen Studien zeigen ferner, dass MMPs, die während der SSC-Kultur freigesetzt werden, die Oberfläche spalten können, jedoch viel weniger effizient.Dies liegt wahrscheinlich daran, dass beobachtet wurde, dass die SSCs geringe Mengen von ~ 10 ng und ~ 0,4 ng MMP-2 bzw. -9 exprimieren, wobei nur MMP-2 in der aktiven Form zu einer unvollständigen Entfernung von PEG führt.Wenn SSCs auf den durch Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) hergestellten Oberflächen kultiviert wurden, wurde eine vergleichbare Lebensfähigkeit, metabolische Aktivität und Wachstum wie bei SSCs beobachtet, die auf der Glasdeckglaskontrolle kultiviert wurden.Die Verwendung von RGE anstelle von RGD führte zu einer verringerten Zelladhäsion und -ausbreitung, was zeigt, dass RGD im DIGE-D vorhanden war, damit die Zellen darauf reagieren konnten;auf mit PEG blockiertem RGE konnten SSCs anhaften und wachsen.Die Expression von Stro-1 mit der Zeit in Kultur zeigte auf DIGE-D ein ähnliches Profil wie auf der Glaskontrolle.Obwohl der SSC-Phänotyp durch die gestaltete Oberfläche nicht aktiv verbessert wurde, war die Oberfläche somit nicht schädlich für den SSC-Phänotyp.Typischerweise benötigen SSCs, die sich entlang der Osteoblastenlinie differenzieren, unter osteogenen Bedingungen etwa 3–4 Wochen, um reife Osteoblastenmarker wie Osteopontin und Osteocalcin zu exprimieren19,20.In den aktuellen Studien waren ungefähr 6 Wochen Kultur erforderlich, um die Expression dieser Marker auf der DIGE-D-Oberfläche zu beobachten.Dies deutet auf eine verzögerte Expression hin, da die Zellen die Oberfläche von „wachsen“ auf „differenzieren“ umschalteten.Wir haben eine Oberfläche hergestellt, die SSC-Wachstum gefolgt von SSC-Differenzierung erlaubt, wenn die Zellen ausreichend MMP-2 produzieren.Es besteht eindeutig Optimierungsbedarf.Wir schlagen vor, dass die RGD-Gruppen besser versteckt werden müssen, um die Retention des SSC-Phänotyps relativ zu Glas während der Wachstumsphase zu verbessern.Anschließend ist eine Optimierung der Spaltung erforderlich, damit genügend PEG gespalten werden kann, um eine robuste Osteogenese voranzutreiben.Während Kontrollen mit geringer Adhäsion die Adhäsion und Ausbreitung verringerten, konnten sich die Zellen festsetzen und wachsen.Diese Studien zeigen, dass unsere Zukunftsvision von zellgesteuerten Oberflächen machbar ist und weitere Untersuchungen rechtfertigt.Oberflächen wurden unter Verwendung von SPPS (Festphasen-Peptidsynthese) wie in Lit. 38 (Todd et al. 36) synthetisiert.Kurz gesagt, Glasdeckgläser wurden in Aceton, Ethanol, Methanol, deionisiertem Wasser (dH 2 O) jeweils 10 min lang beschallt und in einer Abzugshaube trocknen gelassen.Die getrockneten Deckgläser wurden in Piranha-Lösung (H 2 O 2 : H 2 SO 4 , 3:7) für 1 h säuregereinigt.Die Deckgläser wurden dann in deionisiertem Wasser (dH2O) gespült, bis die Lösung neutralisiert war, und die Deckgläser wurden einzeln in 3 × dH2O gespült, bevor sie mit Stickstoff getrocknet wurden.Nach Piehler et al.Oberflächen wurden durch Eintauchen der Deckgläser in GOPTS ((3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilan, Sigma Aldrich, UK) bei 37 °C für 1 h silanisiert, gefolgt von 3× Waschen in Aceton und Trocknen über Nacht bei 75 °C in einem Ofen.PEG26-NH2 (Polypure, Norwegen) wurde bei 75 °C für 48 h auf die silanisierte Oberfläche geschmolzen, um eine Amin-funktionalisierte Monoschicht zu erzeugen.Überschüssiges PEG26-NH2 wurde durch 3x Waschen der Oberflächen mit dH2O entfernt und unter Stickstoff getrocknet.Zum Aufbau der Peptidkette wurde die erste Fmoc-geschützte Aminosäure (20 mM, Sigma Aldrich, UK) an PEG26-Diamin in einer Lösung aus EHICA (Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetat, 0,4 mmol) und DIC (N,N′- Diisopropylcarbodiimid, 0,4 mmol) pro 10 ml wasserfreiem DMF (N,N-Dimethylformamid) (alle Reagenzien von Sigma Aldrich, UK).Die Proben wurden 2 h lang unter Rühren behandelt.Die Proben wurden dann jeweils 10 min unter Rühren in DMF, Ethanol, Methanol und DMF gespült.Für die Konjugation nachfolgender Aminosäuren wurde die Fmoc-Schutzgruppe (der gebundenen Aminosäure) unter Verwendung von Piperidin (20 % in DMF, Sigma Aldrich, UK) für 2 h unter Rühren entfernt, dann in DMF, Ethanol, Methanol und DMF gewaschen 10 Minuten.Die nächste Fmoc-geschützte Aminosäure wurde hinzugefügt und die letzten beiden Schritte wurden wiederholt, bis die Sequenz vollständig war.Die Fmoc-Schutzgruppe wurde von dem endgültigen Peptid entfernt, dann wurde PEG (O-Methyl-O'-succinylpolyethylenglycol 2.000, Sigma Aldrich, UK) vor der Entfernung der Seitenketten an die endständige Aminosäure angefügt.Die Seitenkettenschutzgruppen an der Asparaginsäure (O-tert.-Butyl, OtBu) und dem Arginin (Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl, Pbf) wurden mit einer 90%igen Lösung von wässriger TFA (Trifluoressigsäure, Sigma Aldrich, UK) entfernt 4 Std.Die Proben wurden dann gewaschen und bis zur weiteren Verwendung in einem Exsikkator gelagert.Die Deckgläser wurden nach der Fmoc-geschützten Aminosäureaddition und nach der Entschützung durch Piperidin aufbewahrt, um alle Stadien von SPPS anzuzeigen.Die Deckgläser wurden getrocknet und auf einen Objektträger aufgebracht, und die Fluoreszenzspektren wurden mit einem JASCO FP-6500-Spektrophotometer unter Verwendung einer Technik aufgezeichnet, die von Zelzer et al.44 speziell für SPPS-Deckgläser entwickelt wurde.Die Deckgläser wurden um 30° vom einfallenden Licht abgewinkelt und einem Emissionsspektrum = 270 nm und einem Anregungsspektrum = 320 nm mit einer Spaltbreite von 20 nm (Lichtquelle und Detektor) ausgesetzt.Wasserkontaktwinkelmessungen wurden unter Verwendung der Technik des ruhenden Tropfens (3 &mgr;l Tröpfchen, 5 Mal pro Deckglas in dreifacher Ausführung) durchgeführt.Die Winkelaufzeichnung wurde unter Verwendung eines optischen Theta-Tensiometers (Biolin Scientific, Stockholm, Schweden) durchgeführt.ToF-SIMS wurde mit einem ION-TOF TOF-SIMS IV-Instrument (Münster, Deutschland) durchgeführt, das mit einer Bi-Flüssigmetall-Ionenkanone (LMIG) ausgestattet war.Der Primärionenstrahl wurde unter einem Winkel von 45° zur Normalen auf die Probe gerichtet;25 keV Bi3+-Primärionen wurden in allen Messungen verwendet.Die Aufladung der Probe wurde unter Verwendung niederenergetischer Elektronen aus der Flutkanone kompensiert.Bilder mit großem Maßstab (3 mm × 3 mm; 304 × 304 Pixel) und kleinen Maßstab (380 μm × 380 μm, 256 × 256 Pixel) wurden mit positiver Polarität für jede Probe (1 Aufnahme pro Pixel) erhalten.Positive Ionenmassenspektren wurden mit m/z 15 (CH3+), 29 (C2H5+), 41 (C3H5+), 67 (C5H7+) und 91 (C7H7+) kalibriert.Eine Peak-Suche wurde durchgeführt, um Ionen zu identifizieren, die auf Aminosäuren hinweisen, gemäß Daten, die zuvor in der Literatur berichtet wurden (Wagner und Castner46).Für den halbquantitativen Vergleich der Ionenintensitäten wurden die großformatigen Bilder in vier interessierende Regionen (ROIs) von 1,5 mm × 1,5 mm unterteilt, aus denen die Intensitäten der interessierenden Ionen generiert wurden.Die für den Peakformvergleich verwendeten Spektren wurden aus den kleinformatigen Bildern extrahiert.STRO-1 Ausgewählte SSCs.STRO-1 + SSCs wurden aus menschlichen Knochenmarksabfällen gewonnen, die von hämatologisch normalen Patienten erhalten wurden, die sich im Southampton General Hospital und im Spire Southampton Hospital nach informierter Zustimmung einer Hüftgelenksersatzoperation unterzogen.Die Verwendung der Proben wurde von der lokalen Ethikkommission der University of Southampton genehmigt (NRES-Nummer: 194/99/1, LREC-Nummer: 31875) und alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.Zellen wurden aus trabekulären Knochenmarksproben abgesaugt und bei 250 × g für 4 min bei 4 °C zentrifugiert.Das Zellpellet wurde in &agr;-MEM resuspendiert und durch ein Nylonsieb mit 70 &mgr;m Poren (BD Biosciences) geleitet.Rote Blutkörperchen wurden durch Zentrifugation mit Lymphoprep-Gradientenlösung (Robbins Scientific) entfernt und die verbleibenden Zellen in der Leukozytenschicht in 10 ml Blockierungslösung (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure, HEPES) mit Kochsalzlösung resuspendiert 5 % v/v fötales Kälberserum, 5 % v/v Humanserum und 1 % w/v Rinderserumalbumin (BSA).Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed PubMed Central ADS Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarAuflösungArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed PubMed Central ADS Google ScholarInt.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarErw.Chem.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed PubMed Central ADS Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarAuflösungArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarChem.Int.Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.